甲斐拓也/ブルービート（演：土屋大輔）: 初代ビーファイターのリーダー。新ビーファイター計画の開発主任であり、ネオインセクトアーマーを開発した。
普段はニューヨーク支部に配属されている。
片霧大作/ジースタッグ（演：金井茂）: 「前作」とは違ったワイルドな風貌で登場するが、舞に否定されたため元に戻してしまう。
普段はヨーロッパ支部に派遣されている。
鷹取舞/レッドル（声：巴千草）: 相変わらずの明るく能天気な性格であるが、先輩として成長した部分も見え隠れする。
配属支部は不明。

小山内勝（演：山口良一）: 地球の環境保護を目的とする対侵略者組織・コスモアカデミアの日本支部長。
ビーファイターの基地・ビートルベースにいて、あらゆる面でビーファイターの戦いをサポートする。
鳥羽ゆい（演：麻生かおり）: 甲平の妹。海外赴任中の両親に代わり家事全般を一手に引き受けるしっかり者。
ブラコンであり、兄・甲平をかなり慕っている。
人工生命体ビット（声：半場友恵）: ビートルベースのコンピューター内部にいる人工生命体。怪人の分析データなどを送って戦いのサポートをする。
老師（声：田中康郎）: 昆虫族の長老であり、初代ビーファイターを生み出した人物。
「前作」では老師グルと呼ばれていたが、大人の事情によりグルとは呼ばれなくなった。

マザーメルザードとその子供たちで構成される悪の組織。2億年の眠りから目覚め、地球侵略に乗り出す。

皇祖女帝マザーメルザード（声：山崎和佳奈）: メルザード一族の神。あらゆる生物の化石を食べ、それを怪人として蘇らせ、産み落とす。
最終決戦ではジャドーマザーラと呼ばれる邪悪な姿となった。
恐竜武人ライジャ（演：大岡旭）: メルザードの長男。武闘派であり、剣の達人である。地上の生物の化石から生み出された怪人を親衛隊とする。
一度ビーファイターとの戦いで敗れるが、デズルと共に強化復活する。弟や仲間を思いやる面もある。
深海魚人デズル（声：塩沢兼人）: メルザードの次男。頭脳派で、ずる賢い性格である。海中の生物の化石から生み出された怪人を親衛隊とする。
一度ビーファイターとの戦いで敗れるが、ライジャと共に強化復活する。復活後は姿が一変し、不気味になっている。
昆虫剣士ミオーラ（演：吉尾亜希子）: ライジャ親衛隊のリーダー。カマキリのような姿の女剣士であり、ライジャに絶対忠誠を誓っている。
石貝侍従ドード（声：増岡弘）: デズル親衛隊のリーダー。アンモナイトのような頭の小柄な戦士。口癖は「～でゲス」。